Privo di finestre, illuminato solo da luci artificiali, lo studiolo andò trasformandosi nel luogo ove Francesco intraprese la sua carriera di alchimista e ove, nel massimo riserbo e solitudine, effettuò esperimenti e studi degni della migliore tradizione familiare.Francesco chiese al Vasari di creargli un piccolo spazio sontuosamente decorato, entro il quale avrebbe potuto riporre in armadi, resi invisibili da pitture e pannelli, le rarità di cui era avido collezionista. Un magazzino eccelso entro il quale nascondere libri rari, collezioni di monete, oggetti di oreficeria, vetri soffiati, pietre dure, tutti oggetti che erano stati appassionatamente e minuziosamente raccolti nel corso della sua giovane vita. Lo studiolo avrebbe dovuto essere, inoltre, in diretta comunicazione con la camera da letto, in modo che avrebbe potuto recarvisi in qualsiasi momento intendesse.Un Sancta Sanctorum, quindi, voluto per preservare quanto di più caro e importante Francesco aveva avuto modo di collezionare nella sua vita. Al suo interno troviamo i soggetti iconografici disposti secondo i quattro elementi naturali (terra, cielo, acqua, fuoco), una elaborata corrispondenza tra macrocosmo e microcosmo in cui, seguendo la tradizione alchimistica, i metalli erano fatti corrispondere ai pianeti e agli influssi che si riteneva potessero esercitare sugli uomini e sulle regioni del mondo. Entrando nell'arcanum, il ritratto della duchessa Eleonora da Toledo fa pendant con quello di Cosimo I disposto sulla lunetta. Entrambe le cornici presentano nella loro circonferenza sei segni zodiacali. Nel riquadro centrale della volta possiamo osservare, al posto dei tradizionali cavalli che trainano il carro apollineo del Sole, il simbolo del Capricorno, emblema mediceo, e dell'Ariete, segno di Francesco I. L'interesse del duca per la lavorazione dei metalli e delle pietre era principalmente dovuto a una tradizione astrologica che attribuiva alle pietre, ai metalli e alle incisioni, poteri magici.L'unica nota dolente riguardo lo studiolo è che l'ambiente oggi visibile in Palazzo Vecchio è purtroppo il frutto di una ricostruzione operata nel 1910, soprattutto per opera di Giovanni Poggi, chiamato a porre rimedio allo smantellamento degli ambienti originari, avvenuto prima della morte del duca, nel 1586.
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